乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒(LD-L比色法)

乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH或LD)屬于氧化還原酶，能夠催化氫氧原子或電子從一中底物轉(zhuǎn)移到另一種底物上乳

酸脫氫酶是糖酵解和糖異生的一個(gè)極其重要的酶，含有鋅離子，廣泛分布于人和動(dòng)物組織、植物和微生物中，能可逆的催化乳

酸(L)和丙酮S(P)之間的氧化還原反應(yīng)。其反應(yīng)公式：乳酸+NAD+→丙酮s+NADH+H+。其中：L→P為正向反應(yīng)；

P→L為逆向反應(yīng)。

乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒(LD-L比色法)是利用乳酸脫氫酶催化上述正反應(yīng)，即L-乳酸+NAD+→丙酮S+NADH+H+

，在上述反應(yīng)過(guò)程中乳酸氧化成丙酮S，同時(shí)NAD+氧化成NADH，引起340nm處吸光度的升高，其升高速率與樣品中LDH活性

呈正比關(guān)系，通過(guò)分光光度計(jì)或自動(dòng)分析儀檢測(cè)340nm處吸光度升高速率，通過(guò)計(jì)算獲得乳酸脫氫酶的活性。該LD-L法的優(yōu)點(diǎn)

是：1、乳酸鹽和NAD+底物溶液的穩(wěn)定性比LD-P法中的

和NADH底物溶液好；2、線性速率反應(yīng)時(shí)間范圍較寬；3、重復(fù)性比LD-P法和*肼法好；4、準(zhǔn)確性比*肼法好；

5、適用于自動(dòng)分析儀。該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不宜用于臨床診斷或其他用途。

自備材料：

1、蒸餾水

2、離心管

3、水浴鍋或恒溫箱

4、96 孔板、酶標(biāo)儀

操作步驟(僅供參考)：

1、準(zhǔn)備樣品：

①血漿、血清樣品：血漿、血清按照常規(guī)方法制備，可以直接用于本試劑盒的測(cè)定，-20℃

保存 1 個(gè)月有效，用于 ALT/GPT 的檢測(cè)。

②細(xì)胞或組織樣品：取恰當(dāng)細(xì)胞或組織進(jìn)行勻漿，低速離心取上清，-20℃保存 1 個(gè)月有效，

用于 ALT/GPT 的檢測(cè)。

③(選做)樣品準(zhǔn)備完畢后可以用 BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，以便于后續(xù)計(jì)算單

位蛋白重量組織或細(xì)胞內(nèi)的 ALT/GPT 含量。

2、 制作 ALT 標(biāo)準(zhǔn)曲線：取丙酮S標(biāo)準(zhǔn) 1 支，準(zhǔn)確加入標(biāo)準(zhǔn)稀釋液 1ml，充分混勻，

即配制成丙酮標(biāo)準(zhǔn)(100mmol/L)，4℃保存?zhèn)溆?。臨用前，按丙酮標(biāo)準(zhǔn)(100mmol/L)：丙

酮S標(biāo)準(zhǔn)稀釋液=1：49 的比例混合，即為丙酮標(biāo)準(zhǔn)工作液-丙酮標(biāo)準(zhǔn)(2mmol/L)，以 96

孔板，按下表制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，最好設(shè)定平行檢測(cè)孔，求平均值。

混勻，向各管中加入苯肼顯色液 20ul，混勻，37℃孵育 20min，加入 ALT 顯色基液 200ul，

混勻。室溫放置 5min，以蒸餾水調(diào)零，酶標(biāo)儀 505nm 處讀取各管吸光度。各管吸光度均減

去"0"號(hào)管吸光度，所得吸光度差值(縱坐標(biāo))與對(duì)應(yīng)的卡門(mén)酶活力單位(橫坐標(biāo))作圖。注意：

標(biāo)準(zhǔn)品用分光光度計(jì)檢測(cè)參考值在 0.3~0.9 之間，加入 ALT 顯色基液后其顏色依次為黃色至

棕紅色，應(yīng)及時(shí)檢測(cè)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)其顏色會(huì)加深，由于檢測(cè)儀器、操作手法等條件的不

同，參考值范圍會(huì)有波動(dòng)。

3、 ALT 加樣：按照下表設(shè)置對(duì)照孔、測(cè)定孔，溶液應(yīng)按照順序依次加入，并注意避免產(chǎn)生

氣泡。如果樣品中的 ALT 酶活性過(guò)高，可以減少樣品用量或適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。

4、 ALT 測(cè)定：混勻，室溫放置 5min，以蒸餾水調(diào)零，酶標(biāo)儀 505nm 處測(cè)定對(duì)照管、測(cè)定

管的吸光度(即為 A 對(duì)照、A 測(cè)定)，如無(wú) 505nm 可選擇 500~520nm。

計(jì)算：以系列標(biāo)準(zhǔn)孔活力卡門(mén)單位為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以

(A 測(cè)定－A 對(duì)照)之差值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得 ALT 活力卡門(mén)單位

參考范圍：成年健康人血清 ALT：5~25 卡門(mén)單位/ml

注意事項(xiàng)：

1、苯肼顯色液溶解以后，如果仍然有結(jié)晶析出，應(yīng)過(guò)濾后使用或棄用。

2、由于賴氏法的特點(diǎn)，在繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)每個(gè)點(diǎn)最好做 3 管的重復(fù)測(cè)定，求出各標(biāo)準(zhǔn)管的

吸光度均值，減去“0"號(hào)管吸光度均值，對(duì)照賴氏單位繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3、血清中 ALT 活性在室溫可以保存 2 天，4℃保存 1 周，-20℃保存 1 個(gè)月。

4、成批樣本測(cè)定時(shí)一般無(wú)需每份樣本都做自身血清對(duì)照，以試劑空白管代替即可。

5、對(duì)于超過(guò)正常范圍的血清樣本，應(yīng)該進(jìn)行復(fù)測(cè)，復(fù)測(cè)時(shí)每份樣本都應(yīng)做自身血清對(duì)照。

6、嚴(yán)重黃疸、脂血或溶血的血清，可能會(huì)引起測(cè)定管吸光度增高，因此檢測(cè)該類樣本時(shí)應(yīng)

做自身血清標(biāo)本對(duì)照。

7、當(dāng)樣本的酶活力大于 150 卡門(mén)單位時(shí)，應(yīng)將樣本進(jìn)行 5~10 倍稀釋后再行測(cè)定。

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