一文讀懂熒光定量PCR（qPCR）：從原理、熒光染料到Ct值

　　一、核心原理：實時監測與定量分析

　　qPCR在傳統PCR基礎上引入熒光標記系統，通過實時監測每個循環的熒光信號強度，實現擴增產物的動態跟蹤。當熒光信號達到預設閾值時，所經歷的循環數即為Ct值（CycleThreshold）。由于Ct值與起始模板量呈負相關（模板量越多，Ct值越小），結合標準曲線可實現絕對定量或相對定量分析。例如，在疾病診斷中，通過檢測病原體核酸的Ct值，可判斷感染程度；在基因表達研究中，比較不同樣本的Ct值差異，可分析基因表達水平。

　　二、熒光標記體系：染料法與探針法

　　染料法（SYBRGreenI）

　　SYBRGreenI是一種嵌入型熒光染料，可非特異性結合雙鏈DNA（dsDNA）。在游離狀態下，染料熒光微弱；與dsDNA結合后，熒光強度增強1000倍。該方法操作簡便、成本低，但無法區分特異性產物與非特異性擴增（如引物二聚體），需通過熔解曲線分析驗證產物特異性。

　　探針法（TaqMan探針）

　　TaqMan探針為寡核苷酸鏈，5’端標記熒光報告基團，3’端標記淬滅基團。探針完整時，報告基團熒光被淬滅；PCR擴增時，Taq酶的5’→3’外切酶活性切割探針，釋放報告基團，熒光信號與產物量同步累積。該方法特異性強（需引物與探針雙重匹配）、靈敏度高（可檢測單拷貝基因），且支持多重檢測（通過不同熒光標記區分多個靶基因）。

　　三、Ct值：定量分析的核心參數

　　Ct值是qPCR結果解讀的關鍵指標，其大小直接反映起始模板量。例如，在腫瘤標志物檢測中，若患者樣本中某基因的Ct值顯著低于健康人群，可能提示基因過表達，與腫瘤發生相關。此外，Ct值還可用于評估實驗效率：標準曲線斜率接近-3.32時，擴增效率達100%；若斜率偏離，需優化反應條件（如引物濃度、退火溫度）。

　　四、應用場景與優勢

　　qPCR廣泛應用于疾病診斷（如新冠病毒檢測）、基因表達分析、轉基因檢測及SNP分型等領域。其核心優勢包括：

　　高靈敏度：可檢測單拷貝基因；

　　高特異性：探針法通過雙重匹配確保結果準確；

　　實時定量：無需電泳等后處理步驟，避免交叉污染；

　　寬動態范圍：可覆蓋5-6個數量級的模板濃度。

　　從原理到應用，qPCR以熒光信號為“量尺”，為生命科學研究與臨床診斷提供了精準、高效的核酸定量工具。