PCR技術：PCR污染及對策

在PCR實驗中，污染是一個常見且嚴重的問題，可能導致假陽性結果，影響實驗的準確性和可靠性。為有效預防和處理PCR污染，需遵循以下注意事項：

一、實驗分區與操作流程

合理劃分實驗區域：將實驗分為標本處理區、PCR反應液制備區、PCR擴增區和產物分析區，各區域應有明確的隔離和方向性，避免交叉污染。

單向工作流程：從預PCR到后PCR，實行“單向"工作流程，確保在后PCR區域引入的耗材和防護裝備不會未經消毒就回到預PCR區域。

試劑與樣品分離：PCR試劑、PCR反應液應與樣品及PCR產物分開保存，不應放于同一冰盒或冰箱。

二、試劑與材料準備

試劑分裝：所有PCR試劑應在超凈工作臺或負壓工作臺配制和分裝，使用專用加樣器和吸頭，避免交叉污染。

試劑儲存：實驗室自配的試劑（如去離子水、緩沖液等）在使用前應高壓滅菌或過濾除菌。

試劑小量分裝：PCR試劑應小量分裝，以減少重復取樣次數，并置于-20℃保存。

三、實驗操作規范

正確佩戴防護裝備：實驗過程中應戴一次性手套，若不小心濺上反應液，立即更換手套。

避免氣溶膠污染：操作時應勤換手套，進出不同區域或進行模板操作后應及時更換手套；開管動作要輕，以防管內液體濺出或形成氣溶膠。

減少操作污染：在同時進行多個PCR反應時，應制備主反應混合液，再分裝至PCR反應管，最后添加樣品核酸模板，以減少單個添加操作繁瑣造成的污染。

使用防濺污染的吸頭：使用防濺污染的移液器吸頭，減少樣本或試劑中的氣溶膠形成

四、污染監測與處理

設立對照實驗：設立陰陽性對照和空白對照，監測反應體系各成分的污染情況，選擇合適的對照樣品。

污染識別：使用“無模板對照"（NTC），其中NTC孔包含所有qPCR反應組件，但不包含DNA模板。如果在NTC孔中觀察到擴增，可能表明反應組件中存在污染。

污染處理：若發生污染，應設立陰陽性對照監測污染情況，排除試劑污染后，考慮環境污染的可能性，通過追蹤實驗查找污染源，必要時更換實驗場所或重新設計引物。

五、實驗室清潔與消毒

定期清潔：實驗結束后對操作臺面、儀器、實驗用具及環境進行清潔，避免污染。

消毒措施：使用10-15%的漂白溶液（次氯酸鈉）擦拭表面，讓漂白劑作用于表面10至15分鐘后，用去離子水擦拭，最后用70%酒精浸濕的紙巾快速干燥表面。

設備消毒：定期消毒用于準備qPCR反應的表面和設備，包括工作臺面、移液器、冰箱/冷凍室把手、離心機、渦旋器和其他觸點。

六、污染控制技術

UNG法：使用尿嘧啶糖苷酶（UNG）去除PCR產物中的污染，優點是能去除任何來源的污染，且UNG處理可與PCR擴增在同一反應管內進行

DNase I法：采用DNase I法處理反應液污染，適用于去除污染DNA。

固相捕獲法：利用生物素標記的單鏈RNA探針與待擴核酸雜交，再用包被鏈霉親和素的固相載體捕獲雜交核酸，從而去除污染

七、其他注意事項

實驗記錄與驗證：堅持常規清潔工作，設計陰性對照組，連續三天陰性對照沒有起跳，則污染得到控制。

人員培訓：所有操作人員應接受嚴格培訓，確保操作規范，減少人為污染風險。

通過以上措施，可以有效預防和處理PCR污染，確保實驗結果的準確性和可靠性。