ATCC細(xì)胞培養(yǎng)指南（精簡(jiǎn)版）

每天對(duì)待細(xì)胞比孝敬爹媽還用心，那真是捧在手里怕碎了，含在嘴里怕化了，看在眼里怕丟了。如果手里有一份來(lái)自機(jī)構(gòu) ATCC 的《細(xì)胞培養(yǎng)指南》，養(yǎng)細(xì)胞可就得心應(yīng)手多了。下面是細(xì)胞培養(yǎng)指南（精簡(jiǎn)版），值得收藏。

綜述

細(xì)胞要么在培養(yǎng)瓶表面貼壁生長(zhǎng)（錨定依賴性）要么懸浮生長(zhǎng)（非錨定依賴性）。細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂，通常遵循一個(gè)由四個(gè)階段組成的特征性增長(zhǎng)模式：停滯期，對(duì)數(shù)期（指數(shù)期），平穩(wěn)期（平臺(tái)期）和衰退期。

停滯期——將細(xì)胞接種至培養(yǎng)瓶之后，細(xì)胞逐步恢復(fù)的同時(shí)，緩慢生長(zhǎng)。
對(duì)數(shù)期（指數(shù)期）——細(xì)胞進(jìn)入一個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的時(shí)期，一直持續(xù)到整個(gè)生長(zhǎng)表面被占滿或細(xì)胞密度超過(guò)培養(yǎng)基提供營(yíng)養(yǎng)的能力。
平穩(wěn)期——細(xì)胞增殖減慢或停止。
衰退期——如果不更換培養(yǎng)基且細(xì)胞數(shù)量不減少，細(xì)胞活力會(huì)下降，并出現(xiàn)細(xì)胞死亡。

為了確保活力，遺傳穩(wěn)定性和表型穩(wěn)定，必須使細(xì)胞保持在對(duì)數(shù)期。這意味著細(xì)胞需要在進(jìn)入平穩(wěn)增長(zhǎng)階段之前，或在單層細(xì)胞長(zhǎng)成 100% 融合之前，或在懸浮細(xì)胞達(dá)到推薦的最大細(xì)胞密度之前定期進(jìn)行傳代培養(yǎng)。為每個(gè)細(xì)胞系繪制生長(zhǎng)曲線，對(duì)于測(cè)定該細(xì)胞系的生長(zhǎng)特性是必要的。

凍存細(xì)胞復(fù)蘇

培養(yǎng)一個(gè)新的細(xì)胞時(shí)要特別注意培養(yǎng)基一致性的問(wèn)題。雖然大多數(shù)細(xì)胞系可以在不止一種培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，但是當(dāng)培養(yǎng)基改變時(shí)，細(xì)胞的性質(zhì)也會(huì)變化。來(lái)自于不同廠家的培養(yǎng)基，即使名字相同或類似，配方也略有差異。仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)，配方，標(biāo)簽，確保使用正確的培養(yǎng)基。

細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)，應(yīng)以最快速度融化凍存的細(xì)胞溶液，然后迅速與培養(yǎng)基混合，并接種到合適的細(xì)胞瓶中。

復(fù)蘇程序

1. 準(zhǔn)備細(xì)胞培養(yǎng)容器（如 T-75 細(xì)胞瓶），加入至少 10 ml 適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基，并平衡溫度及 pH。

2. 從液氮罐中取出凍存管，并在 37℃（或適合該細(xì)胞的溫度）水浴中緩慢搖動(dòng)至冰晶融化（約 2 min），注意解凍過(guò)程要迅速。

3. 從水浴中取出凍存管，浸泡或者噴撒酒精消毒。后續(xù)的操作，需在無(wú)菌操作臺(tái)中，并保證嚴(yán)格無(wú)菌。

4. 擰開(kāi)凍存管蓋，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有 9 ml 培養(yǎng)基的無(wú)菌離心管中。溫和離心 (125 g×10 min)，棄去上清去除凍存保護(hù)劑。注意不要擾動(dòng)細(xì)胞層。加入 1-2 ml 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，緩慢吹打使細(xì)胞團(tuán)變松散。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含培養(yǎng)基的容器中充分混合。

5.24 小時(shí)后，檢測(cè)細(xì)胞狀態(tài)。

細(xì)胞傳代培養(yǎng)

單層貼壁細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

為了保證單層貼壁細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，需要定期傳代。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)接近指數(shù)生長(zhǎng)后期 (匯合率大約 70% 到 90%)，準(zhǔn)備傳代。針對(duì)傳代過(guò)程，ATCC 提供的產(chǎn)品說(shuō)明中，會(huì)推薦細(xì)胞傳代分配比例和補(bǔ)充培養(yǎng)基策略。

單層貼壁細(xì)胞傳代，需要打斷細(xì)胞之間的連接。對(duì)于比較松散的連接，猛擊培養(yǎng)瓶側(cè)壁，可以分離細(xì)胞。很多情況下，需要胰蛋白酶/EDTA 的蛋白水解酶來(lái)消化。對(duì)于一些細(xì)胞系，需要采用刮等機(jī)械方法分離細(xì)胞。細(xì)胞分離成為單細(xì)胞懸液后，稀釋到適當(dāng)?shù)拿芏炔⑥D(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)瓶中，在適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)培養(yǎng)基中，細(xì)胞將再貼壁生長(zhǎng)和分裂。

由于每種細(xì)胞都是的，孵化時(shí)間和溫度、清洗次數(shù)或溶液配方可能會(huì)有所不同。分離過(guò)程中，應(yīng)用顯微鏡密切觀察細(xì)胞，以防止細(xì)胞損傷。這個(gè)過(guò)程根據(jù)容器使用合適的培養(yǎng)體積。

懸浮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

相對(duì)于單層貼壁細(xì)胞來(lái)說(shuō)，懸浮細(xì)胞的傳代更具有優(yōu)勢(shì)，單層貼壁細(xì)胞需要蛋白水解酶，會(huì)造成細(xì)胞損傷。而懸浮細(xì)胞可以使用稀釋的方法來(lái)傳代，細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有延遲，對(duì)實(shí)驗(yàn)室空間要求較小，傳代培養(yǎng)是線性放大的。比如細(xì)胞可以在發(fā)酵罐中培養(yǎng)。

根據(jù)細(xì)胞類型，懸浮培養(yǎng)接種密度從 2×104 至 5× 105 活細(xì)胞/ml。收獲時(shí)細(xì)胞密度 2×106 細(xì)胞/ml。如果細(xì)胞接種密度過(guò)低，他們將經(jīng)歷增長(zhǎng)延遲階段，增長(zhǎng)非常緩慢甚至死亡。如果細(xì)胞密度過(guò)高，細(xì)胞可能耗盡培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)，而突然si去。

細(xì)胞凍存

隨著細(xì)胞被冷凍至冰點(diǎn)以下，懸液中冰晶和溶質(zhì)的濃度有所增加。如果冷卻過(guò)程中，胞內(nèi)水分可以滲出細(xì)胞，則可以減少胞內(nèi)冰晶。通常 1℃/min 的降溫速度可以促進(jìn)此過(guò)程。但是，水分的喪失會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞收縮，當(dāng)這種收縮達(dá)到一定程度，又會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活性的劇烈下降。冷凍保護(hù)劑，如甘油或者二甲基亞砜（DMSO），可以緩解這種效應(yīng)。細(xì)胞凍存的標(biāo)準(zhǔn)程序是在含有冷凍保護(hù)劑的培養(yǎng)基中，將細(xì)胞緩慢冷凍至–70℃，然后將凍存管轉(zhuǎn)移到液氮中以保持低于–130℃ 的環(huán)境。

有很多方法可以實(shí)現(xiàn) 1℃/min 的降溫速度。電腦控制的可編程電子降溫系統(tǒng)是較好的方式，可以精確保持降溫速度。這也是 ATCC 采用的方法。但這種設(shè)備價(jià)格較高。比較經(jīng)濟(jì)的方式是將凍存管放置于凍存盒中，在低于–70℃ 的冰箱中凍存 24 小時(shí)。之后再轉(zhuǎn)移至液氮長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

以下程序適用于大多數(shù)細(xì)胞。凍存培養(yǎng)基的配方請(qǐng)參考細(xì)胞說(shuō)明書(shū)。凍存時(shí)，細(xì)胞應(yīng)處于指數(shù)生長(zhǎng)期。

1. 凍存前先檢測(cè)細(xì)胞是否受到細(xì)菌、真菌、支原體和病毒的污染。如果確定有污染，應(yīng)將該細(xì)胞銷毀。

2. 凍存培養(yǎng)基由培養(yǎng)基和 5%DMSO 組成。由于 DMSO 的溶解會(huì)放熱，所以不能向細(xì)胞懸液中直接加入未稀釋的 DMSO。

3. 以溫和速度（125 g×10 min）離心收集細(xì)胞，并以 1×106-5×106 活細(xì)胞/ml 的密度重懸細(xì)胞。

4. 在凍存管上標(biāo)記好細(xì)胞名稱，編號(hào)和凍存日期等信息。然后每管加入 1-1.8 ml 細(xì)胞懸液（視凍存管體積）并密封。

5. 室溫條件下，將細(xì)胞在凍存培養(yǎng)基中平衡 15-40 min（勿超）。這段時(shí)間中，可以將細(xì)胞懸液等分加入凍存管中。

6. 將凍存管置于已預(yù)冷至 4℃ 的程序降溫盒，之后置于-70℃（或更冷）的冰箱中至少 24 小時(shí)。或者使用已預(yù)冷至 4℃ 的可編程電子降溫系統(tǒng)。

7. 將凍存管迅速轉(zhuǎn)移至液氮罐或者-130℃ 冰箱。

8. 記錄凍存位置和過(guò)程細(xì)節(jié)等信息。

9.24 小時(shí)后，取出一只凍存管并復(fù)蘇，以測(cè)定細(xì)胞活性和是否污染。