腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基本方法

(二)合成培養(yǎng)基的配制
1、根據(jù)細(xì)胞目錄中的說(shuō)明，按下表選擇合適品牌及貨號(hào)的培養(yǎng)基干粉，用適量超純水充分溶解。 

2、 按要求添加碳酸氫鈉、谷氨酸鈉、HEPES等，充分?jǐn)嚢枋怪芙狻?/span>
3、 調(diào) pH至7.2左右。
4、 加水至最終體積。
5、 在超凈臺(tái)中對(duì)溶液進(jìn)行濾過(guò)除菌，分裝入250 mL或500 mL玻璃瓶中，用翻帽塞塞緊瓶口。
6、 瓶口封好，4℃冰箱貯存。 

(三)小牛血清的處理 
市場(chǎng)上出售的小牛血清一般做了滅菌處理，但在使用前還應(yīng)做熱滅活處理，即通過(guò)加熱的方法破壞補(bǔ)體(近來(lái)也有觀點(diǎn)認(rèn)為熱滅活處理是不必要的)。胎牛血清不必滅活。
1、 將血清加熱至56℃并保持30 min，其間要不時(shí)輕輕晃動(dòng)，使受熱均勻，防止沉淀析出。
2、 處理后的血清貯存于4℃。
3、 小牛血清在使用前最好進(jìn)行篩選以掌握血清的質(zhì)量。 

(四)生長(zhǎng)培養(yǎng)基的配制 
除無(wú)血清培養(yǎng)之外，各種合成培養(yǎng)基在使用前需加入一定量的小牛血清或胎牛血清和抗菌素。

1. 培養(yǎng)基分裝成小瓶(100～200 mL)以便使用，翻帽塞塞緊瓶口。

2. 按如下比例配制： 基本培養(yǎng)基占80％~90％，小牛血清或胎牛血清占10％~20％。 按1％體積分?jǐn)?shù)加入雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素)，使青霉素和鏈霉素的終濃度分別為100 U／mL和100 μ／mL，。

(五)凍存細(xì)胞的復(fù)蘇

1. 應(yīng)遵守慢凍快融的原則。先將水浴鍋調(diào)至37-37。5度，取出凍存的細(xì)胞迅速放入后將細(xì)胞面浸至水面以下不斷搖動(dòng)至融化。

2. 將解凍后的細(xì)胞液在常溫條件下，1000rpm離心5分鐘。

3. 棄上清，用少量培養(yǎng)基將細(xì)胞懸起，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至事先加入5ml培養(yǎng)基的T-25培養(yǎng)瓶中。將細(xì)胞混勻后，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(六)傳代:

對(duì)于貼壁細(xì)胞應(yīng)先吸(倒)盡培養(yǎng)基，吸的越干凈越好，以免中和后加入的消化液，使強(qiáng)度減弱（或PBS洗1－3次）。50ml培養(yǎng)瓶加入消化液約1-3ml，按此比例進(jìn)行消化，(根據(jù)經(jīng)驗(yàn))，晃動(dòng)使消化液鋪均勻置37度培養(yǎng)箱約2-5分鐘，鏡下見(jiàn)細(xì)胞收縮變圓或少數(shù)脫落后，輕輕振動(dòng)瓶底使細(xì)胞全部脫落，加入2-3ml培養(yǎng)基后，輕輕吹打，使細(xì)胞基本成單個(gè)懸浮，然后分置其它無(wú)菌培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加入培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)。

一般傳代可直接將細(xì)胞原液分置其它培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，如要高濃度可先離心1000rpm，5min后加入培養(yǎng)基，輕輕吹勻后，分置其它培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1. 貼壁細(xì)胞:

2. 懸浮細(xì)胞:

(七)凍存 

將貼壁細(xì)胞消化后離心收集，懸浮細(xì)胞直接離心收集，以培養(yǎng)基或胎牛血清重懸細(xì)胞至終濃度約106/ml。加入10%的DMSO。以每管1～2ml分裝至凍存管中。用絕熱材料包裹置-70攝氏度冰箱冷凍過(guò)夜。次日保存到液氮中。 

(八)注意事項(xiàng)

1. 玻璃吸管和玻璃培養(yǎng)瓶的消毒:1)高壓蒸汽滅菌15分鐘以上;2)干烤消毒140度2小時(shí)以上;

2. 無(wú)菌工作臺(tái)先清洗后用75%酒精擦拭干凈，紫外線照射40分鐘以上;各種培養(yǎng)板照射3小時(shí)以上;

3. 培養(yǎng)基(pH7.2)和血清配制好后要做無(wú)菌試驗(yàn):將血清按10%加入培養(yǎng)基內(nèi)，用無(wú)菌的玻璃離心管或玻璃瓶取培養(yǎng)基5-10ml置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2-3天，肉眼見(jiàn)無(wú)渾濁或沉淀等異物。分裝后置4度保存;

4. 消化液(pH7.8)或其它加入液，應(yīng)用高壓蒸汽滅菌或一次性無(wú)菌濾器過(guò)濾除菌，分裝成支置-20度保存;

5. 培養(yǎng)箱應(yīng)先用清水清洗后用75%酒精擦拭一遍(如有紫外線的應(yīng)照射1小時(shí)以上，如有高溫滅菌的應(yīng)按程序來(lái)菌)。至少每月一次。

6. 進(jìn)入操作時(shí)應(yīng)注意先清洗雙手及手腕，然后用75%酒精擦拭，操作時(shí)注意無(wú)菌臺(tái)內(nèi)空間層次。手及物品不要在暴露的瓶口上方來(lái)往，如果數(shù)量較多，培養(yǎng)瓶應(yīng)放在與酒精燈平行地方便于操作，瓶與瓶之間應(yīng)相隔一定的距離，開(kāi)瓶(蓋)時(shí)應(yīng)先用75%酒精反復(fù)擦拭或用燈燒，打開(kāi)后應(yīng)用燈先燒口，然后燒蓋。用完后同樣操作。整個(gè)操作過(guò)程盡量在無(wú)菌臺(tái)靠里面一點(diǎn)。